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安全天然食品防腐剂细菌素

发布时间：2005-12-26

    细菌素(bacteriocin)是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物[1]，某些细菌通过核糖体机制产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质，大多数细菌素只对亲缘关系较近的细菌有毒害作用，产生菌对其产生的细菌素具自身免疫性。虽然细菌素是抵抗诸如单核细胞增生李斯特氏菌(L. monnocytogenes)等食品病原菌的抑菌剂，它们并不同于青霉素等抗生素；传统的多肽抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的，不存在结构基因[2]，而细菌素由基因编码,可以通过基因工程的手加以改造。它们的合成及作用模式与临床使用的抗生素亦不同。此外，对抗生素显示抗性的微生物通常不对细菌素显示交叉抗性，且与抗生素的抗性不一样，细菌素抗性通常不是由遗传决定的。虽然尼生素是商业上使用的唯一的纯化的细菌素，别的如小球菌素(pediocin)，已经在食品中应用。由于食品安全问题正越来越受到国际社会的关注，来源于乳酸菌的能抵抗食品病原菌且无毒性或其它不利影响的抗菌肽的应用已经引起很大的关注。美国每年花在与空肠弯曲菌(Campylobact er jejuni ) 、韦氏梭菌(Clost ridiumperfringens)、大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有关的食品引发的疾病的费用在 6.5~34.9亿美元之间[3]。随着对含有化学防腐剂的食品消费的增多，消费者对食品安全更加关注，出现了对更“天然 " 或“尽量少的加工”食品更大的需求。因此，人们对天然的防腐剂细菌素产生了浓厚的兴趣。文章以尼生素为重点对细菌素与抗生素的区别、活性细菌素分子的形成以及其在食品中的应用进行了较详细的讨论，比较了这两种类型的分子的合成、作用模式及抵抗力和安全性。
    1 细菌素的来源及分类
    为了维持自身的生存或其生态小环境，许多真核生物形成了对抗竞争者或传染者的抗菌防御系统[4]。从许多种类的真核生物中均发现，抗菌肽的产生是其第一层防御，也是其先天免疫性的一部分。有时这些多肽对特定的竞争菌群起作用，有时它们的广谱活性可作为更一般的防御机制。抗菌肽通过不同的机制保护寄主，但最常见的是通过增加靶细胞膜的通透性，导致胞内物质的不可逆泄漏及随后的细胞死亡。来源于真核细胞的抗菌肽具有不同程度的毒性。例如，防御素(defensins)，由人类的嗜中性粒细胞产生，在高浓度时对生产其的细胞有细胞毒素的作用。虽然从真核细胞中分离出了许多种类的抗菌肽，但它们的细胞毒素限制了其在食品中使用。
    细菌素最先发现于 G—菌中。大肠杆菌素由多种抗细菌蛋白组成，它们可以通过各种机制：比如抑制细胞璧的合成，增加靶细胞膜的通透性，或抑制 RNA 或DNA 的活性，杀死亲缘关系较近的细菌[5]。在 G+ 细菌中，乳酸菌已经成为抗菌肽的巨大来源库。如前所述，由细菌产生的抗菌蛋白或多肽称为细菌素(bacteriocins)。它们是核糖体合成的，能杀死亲缘关系较近的细菌。由于细菌素是从诸如肉及膳食产品等食品(通常都含有乳酸菌)中分离得到的，它们已经被人们不自觉地消费了数世纪。一个对乳酸细菌的40种野生型菌株的研究表明其中的35 种产生尼生素[6]。有超过40 个的国家允许使用尼生素，并且已经作为食品防腐剂使用。
    人们常将细菌素与抗生素混淆。从法制的角度来说这将限制它们在食品中的应用，因为包括我国在内的因为许多国家禁止抗生素应用于食品中。所以有必要正确区分细菌素与抗生素。它们的主要区别见表1，细菌素可明显地区别于临床抗生素，可以安全及有效地使用以达到控制食品中目标病原体生长的目的。在此以合成作用模式、抗菌谱、毒性及抵抗机制为基础来区别细菌素与抗生素。
    通常将细菌素分为三或四种类型[7]。第一类(class1)细菌素称为羊毛硫抗生素( lantibiotics)。通常第一类细菌素典型地具有19~50 多个氨基酸不等。第一类细菌素以它们的稀有氨基酸为其主要特征，如羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)，β - 甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，脱氢丙氨酸(DHA)和脱氢丁氨酸(HBD)。第一类又可再分为class 1a 和class 1b。class 1a 细菌素，包括发现于 1928 年的尼生素(nisin)，由阳离子及疏水性多肽组成，可以在靶细胞膜上形成孔道，还含有柔性的结构，而class 1b 类的多肽含有比较刚性的结构。发现于 1948 年的枯草菌素(subtilin)是一种尼生素的类似物，在12 位氨基酸残基上与尼生素不同，亦属于此类。class 1b 细菌素，属于球型多肽。第二类(class II)细菌素指那些细菌生产的小的热稳定的不经修饰的多肽，可以进一步划分。class IIa 包括小球菌素状的李斯特氏活性多肽，具有保守的N端序列 Tyr-Gly-Asn-Gly-Val 及在多肽N端半部有两个半胱氨酸形成的双硫桥键。class IIb 包括由两个不同的多肽组成的细菌素，对其活性来说两个多肽都是必需的。这些多肽的主要氨基酸系列是不同的。那些大的、热不稳定的细菌素组成第三类(class III)。第四类由能够与其它大分子形成大复合物的细菌素组成，其带正电荷及疏水性的特点致使之与粗提物中的其它大分子形成复合物。然而，到目前为止，对第一、第二类细菌素了解得较多，并且是最有可能在食品中应用的，文章将重点讨论这两类细菌素。
    2 活性细菌素及抑菌特性
    2.1 细菌素的合成
    细菌素是在核糖体中合成的。产生活性细菌素的因通常在操纵子簇。研究得较多的是含有产 lantibiotic基因的操纵子。许多含产lantibiotic 基因的操纵子属于class 1a。属于 class 1b 的 mersadicin 的全部基因簇最近也已被阐明。基因编码生产细菌素可以位于染色体，也可以在质粒或转位子中编码。许多nonlantibiotics，比plantaricin、pediocin 及 sakacin 等的遗传规律已经被阐明。而类似情况存在于 lantibiotic 基因(结构、转运、调整基因等)，plantaricin 系统的基因也编码若干细菌素，这些细菌素共用转运及调整基因系统[8]。与细菌素不同，抗生素通常被认为是次生代谢产物，它不是由核糖体合成的。虽然有些抗生素如万古霉素也是由氨基酸组成的，但它们是由酶合成的。实际上，较多抗生素是通过一种多载体含硫模板机制(amultiple-carrierhiotemplate mechanism)合成的，在那里多肽合成酶装配氨基酸以形成抗生素分子[9]。因为细菌素是由一个结构基因编码的，使得活性位点以及结构 - 功能的关系可以简单地通过基因工程加以测定。而不象抗生素那样，需通过化学方法合成或因其基因工程的复杂性致使涉及更多的基因。
    2.2 转译后修饰形成活性细菌素分子
    虽然细菌素由核糖体合成，必需经过转录后修饰才具有活性。编码修饰促酶的基因通常与结构基因紧连。Lantibiotics 经过最广泛的修饰。LanB 是一种跨膜蛋白质，由lantibiotic 生产者转录，且在运出细胞之前经酶修饰。LanC 则参与 lantibiotics 中硫醚键的形成。
    Lantibiotics 合成的一个特点是存在一个 N 端前导多肽( l ead er pept i de) ，接着它的是一个 C 端多肽前体(propeptide)。前导多肽(leader peptide)最初被认为是作为在转录之后修饰涉及的酶的识别位点。使用未经修饰的多肽前体(propeptide)的实验表明它们(多肽前体)也能够被识别及修饰。Lantibiotics 在转录之后的广泛修饰包括若干稀有氨基酸的形成。在 lantibiotics 中发现12 种以上的稀有氨基酸，Nonlantibiotics 的多肽前体(propeptide)也通过前导系列的删除而被修饰[8]。这些修饰对于细菌素的分泌及横跨细胞膜的迁移是必要的。
    2.3 细菌素的免疫性
    细菌素与抗生素的区别在于生产细菌素的细胞对其产物(细菌素)具有免疫力。细菌素中编码免疫蛋白的基因靠近其结构及调整基因。通常细菌素的结构与免疫基因位于同一个操纵子且是紧连的[1 ]。最初认Lantibiotics 的免疫性只与一种免疫基因有关，对尼生素是nis1 而对枯草菌素则是 Spa1，它们分别编码 nis1 及Spal 免疫蛋白。然而，似乎这些细菌素的免疫性是几种蛋白质影响的结果，因为删除可以编码其它蛋白质的基因将改变寄主的免疫性[12]。例如，不产尼生素的对尼生素有抗性的菌株Lac.lactis并不具有编码Nis1免疫蛋白的基因单元，但含有类似于nisF、nisE 及nisG 的基因序列，而这被认为是此菌株对尼生素有抗性的原因。删除 n is G 使得细胞对尼生素的抗性减小。对于第二类class 11)细菌素 nonlantibiotics，免疫现象要简单些。它们具有一种可以编码免疫蛋白的基因。通常，此免疫蛋白是松散地与膜结合在一起的具有50~150氨基酸残基的碱性蛋白。乳球菌素A(Lactococcin A)免疫蛋白(Lcn1)是目前为止研究得最多的。
    2.4 抑菌性及其影响因素
    研究得较多的是尼生素的抑菌性。尼生素主要抑制大部分G+ 菌的生长，包括产芽孢杆菌(如肉毒杆菌)、耐热腐败菌(如嗜热脂肪芽孢杆菌)等。它在食品防腐中的重要价值在于能抑制芽孢细菌(包括嗜热产气芽孢菌)。由于多数 G+ 菌能引起食品腐败，有些并能导致食物中毒等危害人健康，因此尼生素作为食品防腐剂是重要的、有效的。早期的研究认为，尼生素一般对霉菌、酵母菌和G—菌无效。但近期的研究表明，在一定条件下(如冷冻、加热、降低pH 和 EDTA 处理)，一些G —菌如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌、拟杆菌、放线杆菌、克雷伯氏菌，对尼生素敏感。例如，尼生素的溶解性在 pH2 时比pH8 时要高228 倍。在酸性条件下，尼生素对温度较稳定，随着 pH 值的增加，温度越高，尼生素活性下降越显著，pH6 和7 时，121℃、20min 高温后尼生素活性完全丧失。同时，放置温度和时间对尼生素活性也有显著影响，放置温度越高、时间越长，尼生素活性下降越显著。此外，食品的化学成分和物理状态对细菌素的活性有巨大的影响。
    细菌素，特别是lantibiotics，是通过在膜上形成孔，耗尽跨膜电势差(△φ)和 pH 梯度，导致细胞物质的泄漏而抑制靶细胞。细菌素是带疏水片段的正电荷分子，其与靶细胞膜上的带负电荷的磷酸盐基团的静电相互作用被认为有助于其最初的与靶细胞膜的结合。最近的研究表明尼生素活性的复杂性在于，为了杀死细胞必需与细胞膜上的脂质 II 结合[15]。可以推测为了接近诸DNA、RNA、酶及其它位点等靶以杀死靶细胞，细菌素必需首先进入细胞。现在已经证明有一种第二类细菌素可以精确地抑制敏感细菌中的细胞质膜的形成。细菌素对不同靶细胞的作用并不相等，研究者测定了细菌素对特定的菌种及菌株的亲合力，目标菌株的磷脂成分及环境的 pH 值影响 MIC 值[16]。最近有研究表明，似乎在靶细胞膜上的‘入坞分子’(docking molecules)更有利于与细菌素作用并增强细菌素的抑制效果。其它细菌素也可以作用于靶细胞膜的特定位点，这些位点可质。而这些相互作用可以提高细菌素的抑制活性。蛋白质 PAI 及乳球菌素A 都能形成不依赖于电势的孔。乳球菌素能透过敏感细胞囊而其脂质并不受影响。这表明一个细胞表面的类似受体的实体是必需的(如脂质II )[15,16]。
    2.5 细菌素的毒性
    细菌素作为乳酸菌(LAB)的产品已经被人们消费。急性、亚慢性及慢性的研究，以及繁殖、提高敏感性、体外的和交叉抗性的研究均表明尼在ADI(AcceptableDaily Intake )为 2.9mg/ 人 /d 时消费是安全的。包括老鼠及豚鼠试验得知，由于尼生素是口服的，也测定了尼生素对口腔里的微生物菌群的影响，对饮用 1min之后的含尼生素的巧克力牛奶进行化验，发现在唾液中尼生素的浓度活性只是最初的 1/40，控制组唾液只有 1/100 的活性。另外的研究揭示了胃酶对尼生素的影响，胰岛素可使其失活，且被吸收的尼生素对有益微生物菌群没有影响，比如肠道菌群。尼生素是当前最为商业化的细菌素，研究者对其在食品应用的安全性也作了肯定评价。
    3 细菌素在食品中的应用
    到目前为止, 细菌素中只有尼生素批准应用于食品工业。已在全世界 50 多个国家和地区广泛应用其作为食品防腐剂。虽然许多国家对其添加数量和所应用食品的范围有所不同，但有不少国家,如英国、法国、澳大利亚等国对其添加数量则不作任何限制。我国卫生部颁发的GB2760-86 规定，尼生素在罐装食品、植物蛋白食品最大使用量为 0.2g/kg，乳制品、肉制品最大使用量为0.5g/kg，一般参考用量为 0.1~0.2g/kg。作为食品工业普遍使用的一种天然生物防腐剂，尼生素应用前景虽然广阔，但也存在一定的局限性。首先，尼生素的抗菌谱较窄，只对革兰氏阳性菌起作用，而对革兰氏阴性腐败菌、酵母菌、霉菌及病毒尚没有明显的抑制作用。
    其次，食品加工中的一些因素也会影响它的防腐效果。
    包括:(1)在货架期内，食品原材料中来源于微生物、动植物有机体中的蛋白酶或许会降低尼生素的活性。
    (2) 尼生素在酸性环境下热稳定性很高，但在中性或碱性pH
    条件下热稳定性较差。
    (3)因尼生素是一个疏水多肽，所以食品中的脂肪物质会干扰它在食品中的均匀分布，从而影响它的效果。因此，尼生素在液体和均一性的食品中防腐效果较好，在固体和异质性食品中的效果相对要差。
    (4) 尼生素能够与许多化学食品防腐剂，如山梨酸等配合使用，进而有更好的防腐作用，但某些食品添加剂(如焦亚硫酸钠、二氧化钛)对尼生素的活性有负面影响，导致尼生素的降解。
    (5)研究表明，在食品货架期内尼生素的应用效果与它的残留量有直接关系，而它的残留量则取决于贮藏温度、贮藏时间和贮藏食品的pH 值，所以，依据不同的食品来确定尼生素在保存期内的残留量是保证尼生素应用效果的一个重要指标。总之,应用尼生素作防腐剂时，既要考虑其优越性又要考虑其局限性，才能达到更好的效果。
    3.1 在乳制品中的应用
    尼生素已成功应用于硬质干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐装浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶、乳制甜点等制品中。在干酪的加工过程中尼生素是最有效的保护剂，干酪原料经80~100℃巴氏消毒后，梭菌芽孢仍能存活，乳酪中的微生物为丁酸梭菌，酪丁酸梭菌，生孢梭菌，尤其是肉毒梭菌在加工的乳酪中产生毒素。Taylors 等研究表明，在经巴氏处理的干酪中加入500~1000IU/ml 尼生素能阻止梭的生长和毒素的形成，同时还能降低食盐和磷酸盐的用量。酸奶中主要污染菌为霉菌、酵母菌和细菌；采用500IU 尼生素/ml 和耐酸CMC、复合稳定剂A 或B，可延长酸奶的保质期4~8d，且不影响酸奶的感官和品质[16]。
    3.2 在酸性罐头食品中的应用
    在酸性条件下，尼生素的稳定性、溶解度、活性均提高，因而它可成功地应用于高酸性食品(pH ＜4.5)的防腐。低酸或非酸性罐头食品添加了尼生素，也能起到减轻热处理强度的作用。钱平等采用沸水杀菌和添加尼生素相结合的方式，对蔬菜罐头进行杀菌，结果表明，经过处理的罐头感官特性大为改善。张晓东等通过实验证明，尼生素作为一种天然食品防腐剂应用于瓶装酱菜，能够降低酱菜中食盐用量,效果优于化学防腐剂苯酸钠和山梨酸钾。它能有效地抑制乳酸菌再发酵和葡萄球菌、芽胞菌的生长繁殖。尼生素安全性可靠，尼生素的 LD50 值与食盐相当。由于某些国家在食品中不准使用苯甲酸钠，所以尼生素用于瓶装酱菜出口，具有现实意义。添加尼生素的瓶装酱菜其卫生质量符合国家标准,并对产品风味无影响。也可以将其应用于复合薄膜包装酱菜中[。
    3.3 在啤酒中的应用
    由于啤酒含有丰富的营养成分，pH 较低，氧含量低，含糖量较少，加之啤酒中含有酒精，所以啤酒中腐败菌主要是乳酸菌。乳酸菌属的乳酸杆菌和片球菌是啤酒加工过程中最常见的污染菌，是啤酒发酵中最需要防治的有害微生物。对于尼生素在啤酒行业中的应用，英国学者做了大量的实验，他们认为尼生素能够提高啤酒的生物稳定性。尼生素对于生长和发酵阶段的啤酒酵活力、凝聚力和酿造特性没有影响，在啤酒低 pH、酒花物质的环境下，尼生素活性不受影响，但是却几乎能够有效的抑制啤酒中已发现的所有的革兰氏阳性腐败菌，从而提高啤酒的生物稳定性。1985 年，Ogden等用平板打孔法检测得出，啤酒常见腐败菌几乎均能被100IU/ml 尼生素所抑制。尼生素能够抑制啤酒酿造过程中某些有害微生物的生长，可以应用于啤酒酿造的不同阶段[ 18 ]。
    3.4 细菌素在肉制品中的应用
    由于乳酸菌(LAB)通常在肉制品中发现，已经能从这些细菌中生产细菌素。虽然大多数细菌素已经从与食品有关的乳酸菌(LAB)中分离出来，它们并不一定对所有的食品都有效。当然，在适当的条件下许多细菌素有可能应用于食品。其中研究得最多的是尼生素在肉制品中的应用。硝酸盐通常被用来抑制肉制品中梭菌的生长。然而，对安全性的关注促使食品工业去寻找其它可供选择的保存手段，尼生素单独或与低浓度硝酸盐混合可以抑制 Clostridium 的生长。一个常用的试验系统是香肠，因为其腐败常是由可以被细菌素抑制的乳酸菌引起的，Davies 等研究了脂肪含量及磷酸盐乳化剂对香肠中尼生素的抗菌效果的影响，发现体系中低脂肪含量对应于高的尼生素活性。另外一些研究将尼生素与乳酸混合使用，结果表明对 G－细菌具有更高的抑制效果。
    我国是一个乳酸菌等细菌资源丰富的国家，但是，对天然、无毒、安全的食品防腐剂—细菌素的研究起步较晚，因此，要加大力度对细菌素的基础研究和应用研究，坚信细菌素作为一类具有广阔开发应用前景的天然食品防腐剂，将对人类健康有着实际意义。

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